目的:
該研究的目的是使用基于微陣列芯片的單核苷酸(SNP)多態性測量從母體血漿分離的cell free DNA(cell free DNA)來評估基于信息學的無創性產前親子鑒定(胎兒親子鑒定)的診斷準確性。
 
方法:
從21名成年孕婦(胎齡在6至21周齡)取血樣,從相應的生物學父親中取出遺傳樣品。親子性通過在體外受精期間對嬰兒的基因檢測,受孕產品,受精控制和/或植入前基因診斷進行確認。使用HumanCytoSNP-12微陣列芯片擴增并分析親本DNA樣品和母體無漿細胞的DNA。基于信息學的方法測量單核苷酸多態性數據,確認或拒絕親子關系。具有足夠胎兒cell free DNA分數的每個血漿樣品獨立地針對確認的父親和1,820個隨機的不相關的男性數據進行測試。
 
結果:
21個樣品中有一個沒有足夠的胎兒cell free DNA。當對生物父親進行測試時,該測試正確證實了其余20個樣品(100%)的親子關系,P值<10 -4。對于使用不相關男性作為所謂父親的36,400次測試,99.95%(36,382)正確排除了親子關系,0.05%(18)是不確定的。沒有任何錯誤。
結論:
使用單核苷酸多態性微陣列芯片測量的基于信息學分析的胎兒親子鑒定在妊娠早期準確確定親子關系。
關鍵詞:胎兒,無創,親子鑒定,產前
 
 
介紹
可靠的產前親子鑒定需要直接進行絨毛膜取樣或通過羊膜穿刺進行羊水取樣,這兩者都會增加對母親和胎兒造成傷害的風險。羊膜穿刺術的流產風險為1 / 300-1 / 500(參考文獻1),其他并發癥的風險很小。2,3絨毛取樣進行了類似的流產風險和胎兒四肢減少缺陷的1/3000的風險,尤其是當將10周妊娠之前進行。4,5雖然美國婦產科學會建議將這些程序提供給所有孕婦,1 當母親處于遺傳缺陷的高風險時,如積極的第一孕期篩查后,它們最常用。
母親血液中胎兒cell free DNA(cfDNA)的發現表明可以開發胎兒親子鑒定,這將避免與有創操作相關的風險。6雖然胎兒cfDNA在母體循環最初報道十多年前以上,6,7,8使用孕婦外周血一種可靠的,非侵入性的親子測試的發展已經證明難以實現,因為胎兒cfDNA通常包括在總cfDNA的<20%母親血漿并且高度分散。9胎兒cfDNA的有限數量及其通過母體cfDNA的重度稀釋存在重大技術挑戰。這些可以通過將微微陣列芯片或高通量測序(其測量數十萬至數百萬個DNA片段)與復雜的生物信息學技術結合以從母體血漿cfDNA測量獲得的有限胎兒基因型數據中提取最大信息來克服。
我們之前曾報道過這種稱為親本支持的方法,該方法使用來自母本和父本DNA的單核苷酸多態性(SNP)芯片測量來提高噪聲胚胎DNA基因型測量的保真度。10雖然這種方法精確地在單個胚胎細胞的所有24條染色體倍性標識,它并沒有被用于親子鑒定。
在這里,我們使用家長支持算法的一個版本來確定從母體血漿分離的cfDNA所做的cfDNA SNP測量的胎兒組分是否可能是由于所謂的父親造成的。我們報告了21名孕婦測試這種新方法的結果,每個樣本獨立測試了確認的父親以及1,820名無關個人。我們在懷孕6周后就能以100%的準確性鑒定親子關系。
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材料和方法
入選婦女/夫婦的納入標準是在已知親子關系的第一或第二個妊娠期的單胎妊娠。夫妻通過體外受精診所,產科辦公室或在線廣告進行登記。所有符合納入標準的女性都在2011年4月至6月期間入組。妊娠年齡介于6至21周,并且以各種方式證實了親子關系(表1)。21個樣品中的9個在體外通過控制受精已知親代受精,并通過基因型特異性植入前基因診斷再次確認了親子關系。剩余的12份樣本通過獨立的親子鑒定對胎兒或出生后遺傳物質(DNA Diagnostic Center,Fairfield,OH)進行了親子鑒定。所有參與者均獲得書面知情同意書,并在機構審查委員會批準的研究協議下收集遺傳樣本。
 
 
親子鑒定包括用于驗證試驗的樣本類型
將母體血液樣品(?20ml)收集到無細胞血液試管(Streck,Omaha,NE)中,并且將血液樣品(?5ml)收集到EDTA血液收集管中。平均來說,10毫升血漿從每個母體樣品通過雙離心(分離1,600 克 10分鐘,管傳遞,離心16,000個克10分鐘)。根據制造商的說明使用Qiagen(Valencia,CA)循環核酸試劑盒分離母體血漿cfDNA并在45μl緩沖液中洗脫。使用20μl在1x NEB4緩沖液,0.42mmol / l dNTP和2.5U T4 DNA聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)中的20μl洗脫液在20℃下孵育DNA末端30分鐘,并使聚合酶通過在75℃孵育15分鐘而變性。加入3微升連接混合物(0.5μl10x NEB4,1μl10mmol / l三磷酸腺苷,1μlT4多核苷酸激酶(New England Biolabs),0.5μlT4 DNA連接酶(New England Biolabs)),并孵育樣品在16℃24小時,然后在75℃15分鐘。將測試樣品轉移至標準Illumina Infinium測定(Illumina,San Diego,CA),如同母本和所謂的父本基因組DNA樣本一樣。簡而言之,將24μlDNA在37℃下全基因組擴增20-24小時,然后進行片段化和沉淀。除非另有說明,所有后續程序均在Tecan EVO(瑞士M?nnedorf)進行。將沉淀重新懸浮在微微陣列芯片雜交緩沖液中,熱變性,并轉移至Cyto12-SNP微微陣列芯片。將微微陣列芯片在48℃孵育至少16小時,X染色(Infinium II Chemistry),洗滌并掃描。并轉移至Cyto12-SNP微微陣列芯片。將微微陣列芯片在48℃孵育至少16小時,X染色(Infinium II Chemistry),洗滌并掃描。并轉移至Cyto12-SNP微微陣列芯片。將微微陣列芯片在48℃孵育至少16小時,X染色(Infinium II Chemistry),洗滌并掃描。
使用BeadStudio(Illumina)軟件提取微微陣列芯片強度。通過考慮母親純合的常染色體SNP來確定母體血漿中的胎兒部分。基于群體頻率,母體純合SNP組被分成子集,其中胎兒極有可能或極不可能具有與母親相同的基因型。胎兒分數與兩個子集之間觀察到的非等位基因強度的差異成比例。
使用家長支持分析基因分型結果。8對于每個母親和所謂的父親組合,該方法生成一個檢驗統計量,表明該可能父親的基因型占母體血漿cfDNA基因型測量的胎兒組分的多少。測試統計值是為5,000名不相關男性的母親分別計算的,為這種情況創建了一個不相關的男性測試統計分布(圖1和補充圖S1-S19線上)。然后為母親和被指稱的父親計算檢驗統計量,單假設拒絕檢驗確定所謂父親的檢驗統計量是否落在使用無關男性產生的檢驗統計量的分布之下。如果所謂的父親的檢驗統計量被排除在無關男性檢驗統計量分布之外,那么所謂的父親被確定為親生父親。如果所謂父親的檢驗統計量落在無關男性檢驗統計量分布范圍內,則認定他不是生父親。
 
 
 
親子鑒定的父母支持方法。兩個獨立的女性的親子鑒定結果:(a)一個帶有親子鑒定和(b)一個帶有親子鑒定排除。測試統計分布用灰色表示,該區域表示父親包含(指稱父親的P值<10 -4)用綠色表示,指示父親排斥的區域(所指稱的P值> 0.02的父親)用米黃表示,并且該地區表明不確定的親子關系(據稱父親的P值介于10 -4和0.02 之間)用黑色表示。
具體而言,根據無親緣關系的男性分布的所謂父親的檢驗統計量的P值<10 -4時,稱為親子鑒定(確認親子鑒定)。當計算出的P值在10 -4和0.02 之間時(圖1),調用一個不確定的結果(無呼叫)。當計算出的P時,稱為父親排除值> 0.02。當母體cfDNA中的胎兒DNA分數<2%時未做出決定。用于產生預期分配的一組無關個體由來自各種種族背景的個體組成,并且使用不同種族的不相關個體重新計算親子鑒定,包括針對所指稱的父親指示的種族。包含和排除結果由信息學方法自動生成; 不需要人為判斷。
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結果
使用家長支持測試了21個已知親子關系的母親血樣(表1)。由于母體血漿中胎兒cfDNA的比例很低(<2%,表1),因此無法評估一個樣本。對于其余20份胎兒cfDNA充足的樣本,使用確認的父親和隨機設置的1,820名無關男性個體進行了1,821次獨立的親子鑒定,共進行了36,420次親子鑒定。我們在100%(20/20)的病例中證實了親子關系,P值<10 -4(表1)。該測試早在妊娠6周時就準確鑒定親子關系,并且胎兒cfDNA的含量較低。
值得注意的是,99.95%(36,382 / 36,400)的測試使用家長支持正確排除了親子關系。只有18(0.05%)被稱為不確定。沒有一個測試樣品的親子鑒定不正確。
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討論
我們報告了第一個高度準確,無創,臨床可用的產前親子鑒定。傳統的產后親子鑒定包括分析單串聯重復序列并與所謂的父親進行比較。由于大量完整的基因組子DNA可在產后獲得,測量結果穩健,只需15-20個單串聯重復序列即可獲得高度準確的親子鑒定結果。11
在沒有羊膜穿刺術或絨毛膜絨毛取樣的情況下,或者在孕前非常早期,用于確定產前親子鑒定的選項是有限的。雖然從母體血漿中胎兒cfDNA被可靠地測量,12和各種團體已報道了使用聚合酶鏈式反應,胎兒特異性等位基因的擴增和檢測13,14,15,這些方法不包括足夠的胎兒特異性等位基因準確地測量侍和不適合擴大詢問的基因座。
最近報道了30例使用cfDNA正確鑒定親子關系的報道。16但是,這項研究只對比已知的父親一個無關男性。如果真正的父親不是這兩個樣本中的一個,那么這種方法可能會鑒定出一個人的親子關系,這個親子關系比另一個親緣關系更密切,這是由于例如小的種族亞群的親緣關系密切。這強調了對大量無關男性進行檢測的重要性; 在這項研究中,我們測試了5000個隨機個體。
更值得關注的是,他們沒有報告每個測試的準確性,而是報告了30個案例中正確猜測親子鑒定的機會,這是十億分之一 - 通過正確猜測每個測試的親子鑒定的機會計算的數字1/2)并將其提高到30次方(30次測試)。這種綜合統計數據可能具有誤導性,并且在臨床上無用,因為每項測試都不需要非常精確,無法提供令人印象深刻的數字。例如,假設每測試99%的準確度(遠低于99.99%的行業標準),正確猜測30次測試的總體機率仍然是74%。
相比之下,假設使用家長支持計算每個測試的準確率為99%,那么正確猜測所有36,402個呼叫的概率是10 158中的 1 。假設99.99%的準確度,典型的出生后親子鑒定準確度水平,正確猜測所有36,402次呼叫的機會仍然只有2.6%。這表明家長支持方法準確度> 99.99%。
重要的是要注意一個密切相關的男性可能會返回一個假淵源。初步結果顯示,有問題的孩子的祖父祖父或叔父返回測試統計數據,盡管比實際的父親測試統計量小,但P值<10 -4(數據未顯示); 出于這個原因,來自密切相關的所謂父親的樣本必須進行比較以確保正確的親子鑒定。
本文使用的方法通過使用高通量SNP微陣列芯片測量常染色體SNP而避免了基于傳統和基于cfDNA的方法的問題。血漿測量中存在大量的母體cfDNA,當從cfDNA確定胎兒基因型時,這通常導致低信噪比。識別母親的基因型和胎兒分數使我們能夠預測母體信號的數量并相應地進行調整。盡管每個單獨的SNP測量都是有噪聲的,但是將超過300,000個SNP的數據聚合在一起允許高度準確的親子鑒定。該試驗早在妊娠6周時就提供了準確的親子鑒定,胎兒cfDNA分數低至2.3%,這表明親子鑒定可以在妊娠早期進行,當胎兒分數仍然非常低時。
這種方法適用于其他平臺,如新一代測序,最近已用于識別母體血漿中的胎兒cfDNA。17該研究采用大量平行測序方法對來自單個受試者的母親血漿cfDNA進行了測序,鑒定了整個胎兒和母親的基因組。包括父母基因型以組裝胎兒基因組并確定母本與父親的SNP遺傳,而不是在統計親子鑒定中; 該方法缺乏基于信息學的分析,這有助于我們識別和排除親子關系的準確性,并且更加勞動密集,因此不能很好地用于臨床應用。此外,母體單體型是從絨毛絨毛取樣推斷的,因此否定了無創性檢測的優點。我們目前正在嘗試使用新一代測序來驗證家長支持的有效性。
總之,我們報告了一種高度準確的無創臨床可用的產前親子鑒定。需要進行更大規模的研究,以準確確定這種方法在妊娠早期如何識別親子鑒定并確認更大隊列中的療效。
 


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